PRUEBA DE PCR EN MALFORMACIONES DE LAS GRANDES ARTERIAS

T.: Mutaciones de los genes NKX2.5 y GATA4 en el desarrollo de cardiopatías congénitas.

O.: Investigar mutaciones de los genes NKX2.5 y GATA4 a través de secuenciación de ADN y PCR en tiempo real (RT-PCR).

M.: sangre venosa (de 385 pacientes sanos y que padecen alguna enfermedad cardíaca) y tejido del miocardio (de 27 pacientes sometidos a cirugía cardíaca).

A.N.: ADN-genómico de los genes: NKX2.5 y GATA4.

EXTRACCIÓN DEL ADN: se usó el kit de extracción de ADN-genómico de sangre (Empresa biomercado Box Shanghai)

 * L.: Se extrajo 5ml de sangre venosa, se añadió EDTA y se almacenó a -70°C. 

 * S.: ADN genómico 2l, 10xtampón de reacción (MgCl2 25 mmol/L) 5l, dNTP (2,5 mmol/L) 3 μl, cebador (100Mol/L) l para cada uno, enzima Taq 3l, y ddH2O 35l.

 * P.: Mediante espectrofotómetro ultravioleta.

G.:       NKX2.5             pb              

• Exón 1F/1R          565                        
• Exón 2-1F/1R       469                       
• Exón 2-2F/2-2R    442                             

           GATA4               pb

• Exón  1F/1R         779
• Exón 2F/2R          385
• Exón 3F/3R          413
• Exón 4F/4R          504       
• Exón 5F/5R          382
• Exón 6F/6R          457

PCR.: RT-PCR

                  Gen NKX2.5
          Temp. (°C)    Tiempo     Ciclos
P.D.:         95            5 min.       35
D.:            95           45 seg.       35
H.:        53-64          45 seg.       35
E.:            72           45 seg.       35
E.F.:         72           10 min.       35 
                   Gen GATA4
          Temp. (°C)    Tiempo     Ciclos
P.D.:         95            5 min.       35
D.:            95           45 seg.       35
H.:        51-59          45 seg.       35
E.:            72           45 seg.       35
E.F.:         72           10 min.       35 

V.: EFO en gel de agarosa.

LINK BIBLIOGRÁFICO:

1. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378111916303572?via%3Dihub